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如何測定細(xì)胞內(nèi)的pH
瀏覽次數(shù):10665發(fā)布日期:2012-06-12

1.人中性粒細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)pH測定

1). 試劑

·中性粒細(xì)胞從人血液中提取

·HEPES緩沖液

(153 mmol/l NaCl, 5 mmol/l KCl, 5 mmol/l 葡萄糖, 20 mmol/l HEPES, pH 7.4)

·BCECF-AM special packaging

·標(biāo)定用緩沖液

(130 mmol/l KCl, 10 mmol/l NaCl, 1 mmol/l MgSO4, 10 mmol/l Na-MOPS)

·Nigericin

2). 染色及測定方法

a. HEPES制備細(xì)胞懸液,細(xì)胞濃度為4×10e7/ml

b. 加入1 mmol/lBCECF-AM溶液,終濃度為3 µmol/l,在37下孵育30分鐘。

c. HEPES緩沖液充分清洗細(xì)胞外的BCECF-AM和凝集的中性粒細(xì)胞。

d. 用緩沖液將BCECF染色的細(xì)胞制成3×10e7/ml的細(xì)胞懸液。

e. 取適量的細(xì)胞懸液,細(xì)胞數(shù)量為3×10e6/ml,用熒光光度計測定熒光激發(fā)波長500 nm,發(fā)射波長530 nm)

f. 37下孵育10分鐘后,添加刺激藥物,記錄熒光強度的變化。

3).標(biāo)準(zhǔn)曲線

a. 準(zhǔn)確配制標(biāo)定用緩沖液例如pH值:6.6、7.0、7.2、7.47.8、8.2 )。

b. 從細(xì)胞懸液中取3×10e6/ml細(xì)胞,離心清洗后用1 ml標(biāo)定緩沖液混合,制成細(xì)胞懸液。

c. 加入nigericin終濃度為10 µg/ml,孵育約10分鐘后,測定熒光強度。

d. 橫軸為緩沖液的pH值,縱軸為熒光強度作圖。

2.注意事項

a. BCECF很難轉(zhuǎn)入細(xì)胞,可以同Fura 2一樣,用Pluronic F-127等表面活性劑。

b. 關(guān)于兩個激發(fā)波長,詳見參考文獻(xiàn)1)5)。

c. 請先將nigericin用乙醇配制成2 mg/ml的儲備液。

 

 

 

關(guān)于細(xì)胞凋亡熒光染料Hoechst 33342 /PI 雙染2010-8-5

關(guān)于Hoechst 33342

一、原理

正常情況下,熒光染料 Hoechst 33342 只有少量能透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞,使其染上低藍(lán)色。但是當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時,它的細(xì)胞膜通透性增強,因此進(jìn)入凋亡細(xì)胞中的Hoechst 33342 比正常細(xì)胞的多,熒光強度要比正常細(xì)胞中要高。此外,凋亡細(xì)胞的染色體DNA 的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變,從而使該染料能更有效地與DNA 結(jié)合,并且凋亡細(xì)胞膜上的p-糖蛋白泵功能受到損傷不能有效地將Hoechst 33342 排出到細(xì)胞外使之在細(xì)胞內(nèi)積累增加等都使凋亡細(xì)胞的藍(lán)色熒光增強。

二、激發(fā)波長和儀器

使用帶有350nm激發(fā)波長和460nm發(fā)射波長的濾光片的熒光顯微鏡觀察細(xì)胞。

三、毒性

Hoechst 33342對人體有害,請注意適當(dāng)防護(hù),操作時要十分小心,注意穿實驗服并戴一次性手套。

四、操作

1.對于固定的細(xì)胞或組織:
1)對于細(xì)胞或組織樣品,固定后,適當(dāng)洗滌去除固定劑。隨后如果需要進(jìn)行免疫熒光染色,則先進(jìn)行免疫熒光染色,染色完畢后再按后續(xù)步驟進(jìn)行Hoechst 33342染色。如果不需要進(jìn)行其它染色,則直接進(jìn)行后續(xù)的Hoechst 33342染色。
2)對于貼壁細(xì)胞或組織切片,加入少量Hoechst 33342染色液,覆蓋住樣品即可。對于懸浮細(xì)胞,至少加入待測染色樣品體積3倍的染色液,混勻。室溫放置3-5分鐘。
3)吸除Hoechst 33342染色液,用TBSTPBS或生理鹽水洗滌2-3次,每次3-5分鐘。
4)直接在熒光顯微鏡下觀察或封片后熒光顯微鏡下觀察。細(xì)胞發(fā)生凋亡時,會看到凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈致密濃染,或呈碎塊狀致密濃染。
2
。對于活細(xì)胞或組織:
1 加入適當(dāng)量Hoechst 33342染色液,必須充分覆蓋住待染色的樣品,通常對于六孔板一個孔需加入1ml染色液,對于96孔板一個孔需加入100微升染色液。
2)在適宜于細(xì)胞培養(yǎng)的溫度培養(yǎng)10-20分鐘。棄染色液,用PBS或培養(yǎng)液洗滌2-3次即可進(jìn)行熒光檢測。

五、注意事項

1Hoechst 33342染色后的熒光會有淬滅現(xiàn)象,所以建議染色后在當(dāng)天完成檢測,放置時間不宜過長。

2)一般情況下,Hoechst 33342染料的濃度推薦為10-50μM

六、同仁化學(xué)Hoechst 33342的優(yōu)點

1)配制好的容液,減少操作步驟,減小對人體危害。該產(chǎn)品相對DAPI致癌性更小一下。

2)可以和PI一起用于細(xì)胞凋亡檢測,染色后可看出細(xì)胞凋亡情況:正常細(xì)胞為低藍(lán)色/低紅色(Hoechst 33342+/PI+),凋亡細(xì)胞為高藍(lán)色/低紅色(Hoechst33342++/PI+),壞死細(xì)胞為低藍(lán)色/高紅色(Hoechst 33342+/PI++)。

3)對于活細(xì)胞,3334233258穿透膜的能力更強一些。

4)小包裝適用老師做量小的實驗,不會造成試劑浪費。

 

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